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Jul 01 2011


Andrea Martínez (01/07/11) – Identificación de levaduras aisladas en mosto de uva

DÍA 5

Hoy ha sido el último día del Praktikum 2011. La verdad es que desde que me he levantado he estado dándole vueltas al hecho de que ya no voy a volver el lunes al laboratorio a seguir con las levaduras. Realmente, hoy no hemos hecho mucho, ya que sólo quedaba leer los resultados de las tiras API. Con estos resultados y con la ayuda de un programa informático que los analiza, hemos podido por fin averiguar los nombres de las levaduras con las que hemos estado trabajando todos estos días. Entre ellas, hemos encontrado la Candida holmii, la Candida Pulcherrmia y la Candida inconspicua.

Tras finalizar esta actividad hemos estado recolectando información relevante a todo lo que hemos hecho en el ordenador del despacho, lo que nos ayudará a preparar nuestras presentaciones. Ahora a la 13 es la clausura, donde nos despediremos de todos. Sinceramente, ha sido una experiencia increible que me ha permitido conocer nuevos ámbitos y gente con mis mismos gustos. El excelente trato por parte de nuestros tutores Ana y Jorge en todo momento, también ha sido muy importante para nosotras. En general, se han portado muy bien con nosotras, atendiendo a todas nuestras dudas en todo momento y consiguiendo que este proyecto haya sido de lo más agradable. Recomiendo Praktikum a todos los alumnos que muestren interés en realizar estas pequeñas investigaciones que pueden ayudarles en muchos sentidos, y doy las gracias a la UPV por la oportunidad que nos ha brindado.

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Jul 01 2011


Mar 1/07/2011 IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS AISLADAS EN EL MOSTO DE UVA

DÍA 5

Hoy en realidad no hemos hecho gran cosa. Hemos llegado al laboratorio como todas la mañanas y hemos comprobado los resultados obtenidos en la tiras API. Utilizando el programa del ordenador en apiweb y comprobando la turbidez de los distintos pocillos donde habíamos depositado las levaduras, hemos podido identificar el tipo de levaduras con las que hemos trabajado.  Con eso, hemos finalizado nuestro projectoPor fin todo el trabajo realizado ha dado sus frutos! 🙂

Finalmente, mi compañera y yo nos hemos organizado un poco para realizar la presentación que tendremos que grabar la semana que viene con un polimedia, y donde expondremos los resultados de nuestra investigación.

Hoy terminan nuestros días en el proyecto Praktikum. Después de haber estado toda una semana aquí, se me hará no tener que levantarme para venir aquí, no ver a mis compañeros y amigos todas las mañanas, no tener que ponerme la bata para inmediatamente ponerme manos a la obra… Ha sido una experiencia fantástica que creo que nos ha servido a todos para conocer más cómo funciona la UPV, y además, hemos aprendido muchas cosas, nos han orientado bastante para ayudarnos a decidir qué grado cursar en nuestro futuro  y hemos tenido la oportunidad de ver como todo aquello que aprendemos en los libros tiene su aplicación en la vida real.  Y, por encima de todo eso, hemos conocido a un montón de gente fantástica con la que hemos pasado muy buenos ratos.

Por eso, quería dar las gracias a toda la gente que ha hecho posible que pasemos esta semana aquí, y sobre todo a nuestros tutores Ana y Jorge, que desde el primer día han estado encima de mí y de mi compañera y además de enseñarnos, nos han cuidado muy bien y nos han ayudado a disfrutar al máximo de esta experiencia.

Y ahora sí, me despido… hasta siempre! 😀

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Jun 30 2011


Andrea Martínez (30/06/11) – Identificación de levaduras aisladas en mosto de uva

DÍA 4

Hoy es el penúltimo día del Praktikum 2011, y estamos prácticamente finalizando el proyecto. Lo primero que hemos hecho ha sido de nuevo en el despacho de Ana comentar lo que se iba a realizar hoy, así como organizar nuestras ideas con respecto a los resultados. Seguidamente hemos procedido a la preparación del sistema API ID 32C, para poder identificar las levaduras.

Para ello hemos seguido unos pasos sencillos:

  • Tomar varias colonias idénticas de levadura y realizar una suspensión en el tubo de agua estéril de turbidez igual al patrón 2 de McFarland
  • Abrir una ampolla de API C Medium y transferir 250 microlitros de la suspensión anterior
  • Inocular los pocillos de la galería con 135 microlitros con la suspensión realizada en API C Medium
  • Cerrar la tapa e incubar a 28ºC durante 2-3 días

Seguidamente, hemos realizado la lectura de fermentabilidad de azúcares que dejamos ayer incubando, y hemos hecho algunas anotaciones de los resultados, que aún están por organizar. Hemos podido observar cómo algunas de las campanas Durham tenían una burbuja de gas, lo que significa resultado positivo.

Luego hemos hecho una visita al CAMA (Centro Avanzado de Microbiología de Alimentos). Ha sido muy interesante comprobar algunas de las cosas que allí se pueden realizar, así como conocer algunos aparatos que no tenemos en nuestro laboratorio.

En general hoy ha sido un día menos complicado, porque lo que hemos hecho nos ha llevado bastante tiempo. Mañana esperamos poder concluir ya con el proyecto, organizarlo todo, y preparar las tablas de resultados. Y por supuesto, despedirnos de todos, ya que será nuestro último día de prácticas en el laboratorio.

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Jun 30 2011


Mar 30/06/2011 IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS AISLADAS EN EL MOSTO DE UVA

DÍA 4:

Hoy ha sido uno de los días más relajados. A primera hora hemos tenido una pequeña reunión en el despacho de nuestra tutora Ana, para organizarnos el trabajo.

En primer lugar hemos preparado una tira API que mañana nos permitirá caracterizar la levaduras que hemos estado cultivando. El proceso ha sido el siguiente:

  • Hemos tomado varias colonias de levadura aisladas y hemos hecho una suspensión en un tubo con agua destilada estéril.
  • Hemos transferido 250 micro litros de la suspensión a una ampolla de API C Medium y lo hemos homogeneizado con la pipeta.
  • Finalmente, hemos llenado unos pocillos que contienen las tiras API con 135 micro litros de la suspensión realizada en el API C Médium
  • Lo dejaremos incubando a 28ºC y mañana podremos saber los resultados utilizando el Sistema API ID 32C, un programa de ordenador creado por la empresa Biomérieux.

Para finalizar la mañana, hemos ido con nuestro tutor Jorge y nuestros otros dos compañeros de microbiología, Diego y Borja, a visitar el C.A.M.A. ( Centro Avanzado de Microbiología de Alimentos). Allí nos ha mostrado distintos laboratorios muy parecidos a los laboratorios en que hemos estado trabajando estos días.

Mañana solo tedremos que observar los últimos resultados, y comenzar a identificar las diferentes levaduras con las que hemos trabajado. Nuestros días en el politécnico se están acabando, y nos da un poco de pena tenernos que marchar… Pero aún nos queda un día que seguro que disfrutamos al máximo! 🙂

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Jun 29 2011


Mar 29/06/2011 IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS AISLADAS EN EL MOSTO DE UVA

DÍA 3:

Hoy hemos seguido con nuestro trabajo en el laboratorio. En primer lugar, nos hemos llevado una gran sorpresa en observar el medio de cultivo que tocamos con nuestras manos el primer día. Sí, el resultado ha sido claro. Tenemos bacterias en nuestras manos, y no pocas, aunque eso no es precisamente malo, ya que esas bacterias en poca cantidad nos permiten inmunizarnos contra posibles enfermedades.

En segundo lugar hemos continuado con el ensayo sobre la fermentabilidad de los compuestos carbonatados. Para ello, hemos seguido los siguientes pasos:

  • Hemos hecho una suspensión en agua destilada del cultivo de levadura crecido en YPD que hicimos ayer.
  • Una vez mezclado, hemos inoculado  0’5mL de la suspensión a los tubos con los azúcares y la campana de Durham que también preparamos ayer.
  • Finalmente los hemos puesto a incubar a 28ºC.
  • Mañana haremos una lectura de los resultados, y eso nos permitirá saber si la levadura que hemos añadido asimila los azúcares (es decir, lleva a cabo la respiración aerobia) o los fermenta. Si se lleva a cabo una fermentación, se podrá observar el crecimiento y además, se desprenderá dióxido de carbono, y por tanto, podremos observar una burbuja de aire en la campana de Durham.

Con estos datos y los recogidos ayer sobre la morfología de la levaduras, podremos identificar su tipología.

A continuación, hemos sacado los cultivos que hicimos ayer con el mosto de uva y habían crecido algunas diminutas colonias. Las hemos picado con el asa y las hemos trasladado a otro medio de cultivo utilizando también la técnica de la triple estría. Así, hemos conseguido aislar un solo tipo de levadura del mosto, que contiene infinidad de ellas.

Para poder conservar los diferentes tipos de levadura que hemos ido cultivando durante un periodo más largo de tiempo, nos han explicado que uno de los mejores métodos es la congelación. Para ello, hemos trabajado en una campana de flujo laminar, para asegurarnos de que lo que vamos a congelar no está contaminado. El proceso ha sido sencillo. Solo debíamos coger una gran cantidad de levaduras con el asa y trasladarlas a un vial con peptona y glicerol, para crear distintos focos de congelación y que la células no mueran. Después, los hemos metido en el congelador a -20ºC.

Finalmente, hemos hecho una tinción Gram de bacterias, para poder observar las diferencias respecto a las levaduras con las que estamos trabajando. Esta tinción nos ha permitido diferenciar la morfología de las bacterias y además, hemos podido distinguir si eran bacterias Gram positivas (se teñian de morado) o bacterias Gram negativas (se teñian de rosa).

Los pasos a seguir han sido los siguientes:

  • Extender la bacteria con agua destilada en el porta.
  • Desecar con el calor desprendido por el mechero.
  • Fijar cortando la llama del mechero 3 veces.
  • Teñir con violeta de geneciana durante un minuto. Sin lavarlo, remplazarlo por el reactivo de lugol y después dejarlo actuar un minuto.
  • Lavar con agua.
  • Decolorar con alcohol durante 30 segundos.
  • Lavar con agua
  • Teñir con fucsina básica durante 30 minutos.
  • Lavar con agua, secar y observar en el microscopio con una magnificación de 100.

Hemos repetido este proceso con dos bacterias diferentes: Lactobacillus y E.coli. Después de observarlas en el microscopio, hemos observado que… 

  • Los Lactobacillus tienen una forma alargada y forman cadenas. Además se tinta de color morado, por tanto son bacterias Gram positivas.
  • El E.coli es realmente diminuto y tiene forma redondeada. Además, se tinta de color rosa, por tanto son bacterias Gram negativas.

Eso ha sido todo por hoy! Mañana más 🙂

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Jun 29 2011


Andrea Martínez (29/06/11) – Identificación de levaduras aisladas en mosto de uva

DÍA 3

Hoy ha sido el tercer día de esta experiencia. Una vez más hemos tenido la oportunidad de conocer nuevas técnicas de laboratorio y de llevar a cabo bastantes procesos.

Para empezar, después de otra pequeña charla en el despacho de Ana para aclarar en qué se iba a basar nuestro día, hemos terminado el ensayo de fermentación de compuestos carbonados que comenzamos ayer, con el fin de despejar dudas sobre cada tipo de levadura. Esta prueba, junto con la morfología que vimos ayer nos ayudarán a clasificar los tipos de levaduras.

Para realizar esta prueba hemos procedido de la siguiente forma:

  • De un cultivo de levadura crecido, realizamos una suspensión en agua destilada
  • Inoculamos 0,5ml de la suspensión en los tubos de medio de fermentación con campana Durham que preparamos ayer
  • Incubamos a 28ºC y realizamos lecturas a las 24, 48 y 72 horas

Si se da el caso en el que hay crecimiento y gas en la campana Durham, la fermentación es positiva.

Después de esto, hemos comprobado las placas petri que dejamos incubando ayer, donde habíamos aislado las levaduras del mosto de uva. Ya había comenzado a destacar la presencia de varias colonias de levaduras en el medio de cultivo. Hemos picado las colonias y sembrado nuevas placas con el método de triple estría, una vez más. Con esto pretendemos obtener cultivos de las levaduras que podamos conservar, para mantener en todo momento las muestras purificadas y frescas.

También hemos aprendido a hacer tinciones Gram, y a distinguir las positivas de las negativas. Las positivas adquieren un color morado/violeta, mientras que las negativas aparecen de color rosado. El distinto comportamiento en la tinción es debido a diferencias en la estructura y composición química de la pared celular. Para llevarlas a cabo hay que seguir unos pasos importantes. Lo que hemos investigado son bacterias E.coli, y los Lactobacillus. Una vez tenemos la muestra  en el porta, se añade una gota de agua destilada. Se sujeta encima del mechero para evaporarla, y luego se pasa 4 veces muy cerca del foco de la llama con el fin de fijar las bacterias al porta. Hecho esto, se siguen estos pasos:

  • Teñir con violeta de Genciana durante 1 minuto
  • Sin lavar, reemplazar el colorante por el reactivo de Lugol, y dejarlo actuar 1 minuto
  • Lavar con agua
  • Decolorar con alcohol durante aproximadamente 30 segundos, y nunca sobrepasarlos
  • Lavar con agua
  • Teñir con fuchsina básica diluida durante 3 minutos
  • Lavar con agua y dejar secar

Cuando todo esto estaba listo, hemos podido observarlas al microscopio diferenciando entre ellas por su morfología. Las E. coli aparecían muy pequeñas a una ampliación de 100x, por lo que se aprecia que realmente son muy pequeñas. Además tenían forma redondeada. Las Lactobacillus sin embargo, aparecían de forma alargada e incluso formando largas cadenas.

Por último, hemos congelado varias muestras de las levaduras de distintos tipos. Hemos trabajado en una campana de flujo laminar, previamente esterilizado gracias a un foco de luz ultravioleta presente en la misma. Hemos introducido muestras de cada tipo en unos viales (pequeños tubitos) y los hemos metido a un congelador con temperatura de -20ºC.

Ha sido un día completo y bastante interesante desde mi punto de vista. Empiezo a darme cuenta de que hacer el Praktikum ha sido una buena decisión que me ha permitido conocer un campo completamente nuevo para mí. ¡Mañana veremos qué más nos espera!

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Jun 28 2011


Andrea Martínez (28/06/11) – Identificación de levaduras aisladas en mosto de uva

DÍA 2

 

Hoy hemos vuelto al laboratorio de nuevo. Antes de empezar, hemos tenido una pequeña conversación sobre la forma en que están relacionadas las levaduras con la fermentación, la respiración (tanto aerobia como anaerobia), la glucólisis y cómo algunos de los productos importantes obtenidos con la fermentación son el etanol y el CO2.

En primer lugar, hemos procedido a preparar los tubos con el medio de cultivo selectivo, para aislar las diferentes levaduras. Hemos partido de agua destilada estéril, añadiendo 1ml de mosto líquido en cada caso, mezclando y homogeneizando bien. Para aislarlas hemos utilizado un medio sólido, para evitar que se dispersaran físicamente y se mezclaran. El objetivo era aislar las levaduras y obtener una aproximación del número de ellas (cuantificarlas).

Para poder averiguar además la carga microbiana hemos hecho diluciones decimales seriadas. Para llevar esto a cabo, se necesita que el entorno sea aséptico, ya que no es deseable añadir carga microbiana de más. Una vez listas las diluciones, hemos sembrado 0,1ml del contenido de los tubos a las placas petri que contenían YPD con cloranfenicol con un asa digralsky. Hemos hecho este proceso por duplicado, obteniendo 2 muestras por cada disolución. Hemos metido las placas petri en la estufa a 28ºC, por lo que obtendremos los resultados a partir de mañana (24-48h).

A los medios de cultivo que preparamos ayer, los hemos sembrado con el método de triple estría y con el asa de siembra, las diferentes levaduras que queríamos investigar, para asegurar que si se contaminan las muestras siempre tendremos una reserva limpia y pura. Las hemos metido en la estufa a 28ºC y las dejaremos crecer.

Seguidamente, hemos hecho varias tinciones en fresco de distintas levaduras de las que sembramos ayer, ya crecidas. Para ello hemos utilizado portas donde hemos colocado pequeñas muestras de las levaduras, y tras haberlas teñido con azul de metileno diluido con agua destilada, las hemos cubierto con cubres. Luego las hemos observado con el microscopio fijándonos bien en cada detalle. Hemos podido distinguir a las levaduras Saccharomyces por su forma redondeada de otras con forma apiculada (forma de limón) entre otras, lo cual me ha parecido muy interesante. Incluso hemos podido apreciar algunas levaduras en proceso de gemación.

Además de esto, Ana nos ha explicado que las levaduras se dividen por gemación, y cada una muestra una gemación característica. Las levaduras apiculadas fermentan espontáneamente, proporcionando a los vinos una peculiaridad única.

Por último, hemos empezado a preparar el experimento que llevaremos a cabo mañana. Se trata de ver qué azúcares fermentan los distintos tipos de levaduras. Jorge nos ha explicado el proceso y hemos realizado algunos de los pasos. Los azúcares con los que podremos trabajar son:

  • Glucosa
  • Fructosa
  • Maltosa
  • Lactosa
  • Almidón

Todos ellos a una concentración del 6% excepto el almidón, al 10%. Hemos preparado tubos con cada uno de los azúcares. Para cada levadura (6 tipos) hemos hecho 5 tubos (uno con cada tipo de azúcar).

Para llevar a cabo este experimento, hay que preparar un medio basal (4ml por tubo), esterilizarlo en el autoclave y repartirlo en los 30 tubos. Luego se añaden 2ml filtrados de cada uno de los azúcares por tubo. Gracias a la campana Durham que hemos incluido, podremos recoger los gases emitidos, y comprobar si las fermentaciones se han llevado a cabo, y de qué forma.

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Jun 28 2011


Mar 28/06/2011 IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS AISLADAS EN EL MOSTO DE UVA

DÍA 2

En general hoy ha sido un día bastante ajetreado, y no sé si seré capaz de escribir todo lo que hemos hecho en 40 min, así que intentaré hacer un pequeño resumen.

El trabajo llevado a cabo hoy se puede dividir en 3 partes:

En primer lugar, hemos llevado a cabo un aislamiento del mosto de uva, que nos permitirá conocer la carga microbiana, es decir, el tipo de levaduras y la cantidad de ellas que se encuentra en el mosto de uva.

  • Para ello, hemos utilizado un medio selectivo (inhibe el crecimiento de bacterias), una muestra líquida de mosto y agua destilada esterilizada.
  • Lo que hemos hecho ha sido añadir 1mL de mosto a 9mL de agua destilada, repitiendo esa operación un total de 4 veces. Por tanto, adquirimos 5 diluciones decimales seriadas, con distinta concentración de mosto.
  • A continuación hemos sembrado las 5 diluciones en 10 medios de cultivos (dos por cada dilución). Para transferir el líquido hemos utilizado una pipeta y para dispersarlo hemos utilizado asas de Digralsky.
  • Finalmente, las hemos introducido en las estufas a 28ºC y tendremos que esperar entre 24 y 48 horas para ver los resultados. 

 

Por otra parte, hemos llevado a cabo una observación con el microscopio de las distintas levaduras que cultivamos ayer, que habían crecido con éxito. Eso nos permitiría diferenciarlas según su morfología.

  • Antes de todo, hemos hecho una copia de seguridad de todas las levaduras obtenidas, llevando a cabo otra vez la técnica de la triple estría. Así, si las muestras que vamos a manipular para observarlas se contaminan, tenemos otras guardadas.
  • Una vez hecho este paso previo, hemos hecho una tinción en fresco de la levadura Saccharomyces y de otras 5 muestras más de levaduras. Para hacerlo, hemos necesitado portas, cubres y azul de metileno mezclado con agua destilada.
  • A continuación hemos observado las muestras y hemos intentado distinguir los distintos tipos de levaduras por su morfología. Esto último ha sido un poco difícil, ya que todas las levaduras eran muy parecidas. Una cosa curiosa en algunas de ellas, como en el caso de la Saccharomyces, era observar como algunas de las levaduras se estaban dividiendo por gemación.

 

Otra forma de poder distinguir los diferentes tipos de levaduras es conocer el azúcar que fermentan los diferentes tipos de ellas. Hemos preparado una prueba que llevaremos a cabo mañana:

  • En primer lugar preparamos tubos de ensayo donde añadiremos el medio basal. Éste está formado por extracto de levadura, peptona y agua destilada.  Lo hemos esterilizado y le hemos colocado la campana de Durham. Ésta nos indicará si la levadura fermenta o no el azúcar, ya que si hay fermentación, habrá expulsión de gases, y por tanto aparecerá una pequeña burbuja en la campana.
  • A continuación hemos añadido a las disoluciones los diferentes azúcares por filtración. Los azúcares que hemos añadido son glucosa, fructosa, maltosa, lactosa y almidón. Para ello hemos utilizado un filtro que permite pasar la disolución impidiendo el paso de las bacterias, para así, conseguir que la muestra esté esterilizada.

Mañana llevaremos a cabo la prueba que nos permitirá distinguir si las levaduras fermentan los azúcares o no.

Y ahora, después de todo este trabajo, nos espera una comida bien merecida! 😀

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Jun 27 2011


Andrea Martínez (27/06/11) – Identificación de levaduras aisladas en mosto de uva

Proyecto 3.8- Identificación de levaduras aisladas en mosto de uva

DÍA 1

Hoy ha sido nuestro primer día en Praktikum. Por la mañana hemos asistido a una reunión en la que nos han explicado brevemente cuatro de los grados que se pueden hacer en la Universidad Politécnica de Valencia. Éstos son: Grado en Biotecnología, Grado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Grado en Ingeniería Agroalimentaria y del Medio Rural y Grado en Ingeniería Forestal y del Medio Natural.

Después de esto, los tutores que nos han asignado, Ana y Jorge, nos han llevado a mi compañera Mar y a mí a conocer el área por donde deberemos movernos en los próximos días. Hemos visto los laboratorios así como algunos despachos y otras zonas del edificio.

Una vez instaladas, hemos dejado nuestras cosas en una taquilla y nos hemos puesto la bata para entrar al laboratorio. Para comenzar, nos han hablado del tema de las levaduras y su papel en la fermentación alcohólica. Nos han comentado que nuestro proyecto trataría sobre el cultivo, la purificación y la identificación de distintos cultivos de levaduras aisladas de mosto de uva, lo que se denomina selección clonal.

Esta selección clonal consiste en obtener levaduras autóctonas con buenas características enológicas, partiendo de una sóla célula para así obtener colonias con el mismo genoma. Para llevarla a cabo, podemos utilizar mosto obtenido a partir de las uvas, una vez maduras, o aislar las levaduras, que se encuentran adheridas a la pruina (capa cerúlea del grano de uva). Cabe resaltar el hecho de que cuanto más madura está la uva, más se adhieren las levaduras.

A continuación nos han dado una hoja de normas de seguridad en el laboratorio de microbiología, las cuales hay que tener muy en cuenta a la hora de manipular cualquier cosa en el laboratorio. La lista de normas incluye datos muy interesantes, como por ejemplo:

  • Lavarse las manos antes de entrar en el laboratorio y tras finalizar la sesión de prácticas
  • Llevar el pelo recogido
  • Evitar los guantes de látex si se trabaja cerca del mechero, ya que las quemaduras son muy peligrosas
  • Después de los análisis, los cultivos se retirarán para su destrucción en autoclave

Estas normas aseguran que el trabajo en el laboratorio sea completamente seguro para todos aquellos que las respeten.

Una vez asimilada esta información, hemos entrado en acción con nuestro primer pequeño experimento. Lo hemos llamado “¿Están en mis manos los microorganismos?”. El procedimiento ha sido sencillo. En un medio de cultivo general hemos tocado con las manos sin lavar. Lo hemos metido en una estufa a 28ºC y mañana comprobaremos el resultado.

Luego hemos empezado a preparar un medio de cultivo, formado por YPD, y otro igual al que además le hemos añadido cloranfenicol. El segundo se trata de un medio de cultivo selectivo, que inhibe el crecimiento de las bacterias, pero no el de las levaduras. El YPD está compuesto de: extracto de levadura, peptona, glucosa (a lo que se añade agua destilada).

Las cantidades que hemos añadido para preparar 300ml de medio de cultivo han sido:

  • 15g de polvo YPD Broth
  • 4,5g de agar para conseguir algo de solidez
  • 0,15g de cloranfenicol en sólo uno de ellos

Una vez lista la mezcla en el erlenmeyer, la hemos agitado bien, hemos tapado la abertura con un algodón y papel de aluminio por encima para evitar que se contamine una vez sacado del autoclave. Nos han recalcado que el recipiente en el que se hace esto ha de tener una capacidad de al menos el doble del volumen de mezcla que prepararemos, puesto que al hervir podría salirse si fuera demasiado pequeño. Una vez controlado esto, hemos metido las mezclas en el autoclave.

Este aparato es un recipiente metálico de paredes gruesas con cierre hermético que permite trabajar a altas temperaturas y presiones, para realizar una esterilización con vapor de agua. Funciona eliminando por completo el aire contaminado que haya quedado en el interior al cerrarlo, y sustituyéndolo totalmente por vapor de agua. Pasados unos 20 minutos (según el programa que elijas) el interior del autoclave estará estéril.

Para finalizar el día de hoy, hemos aprendido a aislar microorganismos de un medio de cultivo. Para ello, hay que realizar una triple estría. Se utiliza un asa de siembra, un mechero, y una placa petri con medio de cultivo. El procedimiento consiste en esterilizar el asa de siembra (compuesta por una aleación de Níquel y Cromo) calentándola con el mechero hasta que se pone al rojo vivo. Para no quemar los microorganismos, hay que esperar unos segundos con el asa de siembra cerca del mechero, pero no encima, de modo que baja la temperatura. Se coge una muestra del microorganismo y se esparce en el medio de cultivo suavemente, creando la primera estría. Se vuelve a esterilizar el asa de siembra para arrastrar de esa estría una segunda y se repite el proceso para obtener la tercera. El resultado debería ser la obtención de colonias aisladas.

Tras realizar este proceso de aislamiento de microorganismos varias veces, hemos metido las placas petri en las estufas a 28ºC, esperando que entre 24-48 horas tengamos los primeros resultados, ya que estas levaduras se dividen por fisión binaria y su crecimiento es exponencial (2^n), lo que quiere decir que en poco tiempo pueden llegar a formar colonias con grandes cantidades de microorganismos. Una de las levaduras que hemos utilizado se llama Saccharomyces cerevisiae, y ha de incubarse a 28ºC. Contrariamente a ellas, las bacterias Lactobacillus delbruekii bulgaricus han de incubarse a 37ºC.

Por último, hemos visto una jarra de anaerobio, donde hemos metido el cultivo de bacterias antes de llevarlo a la estufa a 37ºC, que encuentran un mejor medio para vivir en zonas poco e incluso nada oxigenadas (microaerofílicos y anaerobios respectivamente). Hemos añadido un sobre dentro de la jarra de anaerobio que reacciona con el oxígeno de su interior dejandolo al 5% de concentración.

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Jun 27 2011


Mar 27/06/2011: IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS AISLADAS EN EL MOSTO DE UVA

DÍA 1:

Hoy ha sido nuestro primer día en el proyecto Praktikum. En primer lugar nos han hecho una pequeña presentación hablándonos de 4 de los grados que se pueden cursar en la Universidad Politécnica de Valencia. Éstos son: 

  • Grado en Ingeniería Agroalimentaria y del Media Rural
  • Grado en Ingeniería Forestal y del Media Natural
  • Grado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos
  • Grado en Biotecnología

A continuación nos han dividido en los distintos grupos de trabajo y nos han presentado a nuestros respectivos tutores, Ana y Jorge, y a mi compañera, Andrea. Nos han enseñado la zona donde permaneceremos esta semana y el laboratorio de microbiología donde llevaremos a cabo la investigación.

En primer lugar, nos han introducido de forma general cual iba a ser el objetivo de nuestro trabajo. Durante los días siguientes nos dedicaríamos a cultivar, purificar e identificar distintos cultivos de levaduras aisladas de mosto de uva. Ese proceso se denomina selección clonal, y nos permite obtener levaduras autóctonas con buenas características enológicas. Una de las cosas que me ha llamado la atención ha sido saber que las levaduras se encuentran en la capa externa de la uva, y esa es la razón por la cual la uva no fermenta cuando está entera, pero al triturarla, las levaduras pasan al interior y comienzan la fermentación. También ha sido curioso descubrir que no hay una sola levadura encargada de llevar a cabo la fermentación de vino, sino que hay infinidad de ellas.

Pero antes de pasar a la acción, era necesario que conociéramos una serie de normas de laboratorio necesarias para nuestra seguridad. Debemos llevar siempre la bata, el pelo recogido, y debemos lavarnos las manos tanto al entrar y al salir del laboratorio. También han insistido en la importancia de la esterilización, ja que en un laboratorio de microbiología se debe controlar que es lo que estas cultivando.

Una vez hecha toda esta introducción, hemos pasado a la práctica. En primer lugar, como prueba de que los microorganismos están por todas partes, hemos tocado con la palma de la mano un medio de cultivo y la hemos colocado en la estufa a 28ºC para que las bacterias crezcan en condiciones favorables. Mañana veremos los resultados de nuestro experimento.

Nuestra próxima tarea era crear nosotras mismas el medio de cultivo donde vamos a cultivar las levaduras. Para crear 300 mL de medio de cultivo hemos mezclado 300mL de agua destilada, 15g de polvo YPD (el cual contiene extracto de levadura, peptona y glucosa) y 4’5 g de agar agar, que hará que la disolución se solidifique. Hemos creado dos disoluciones: una con los productos anteriores, y otra a la que hemos  añadido cloranfenicol, que se encargará de inhibir el crecimiento de procariotas, pero permitiendo el crecimiento de levaduras.

Después de mezclar estas disoluciones ha llegado la hora de esterilizarlas con la ayuda de una máquina llamada autoclave. Ésta se trata de una recipiente donde se almacenan los productos que se quieren esterilizar. Después de cerrarlo herméticamente, el funcionamiento de la máquina se asemeja al de una gran olla de vapor. El interior del autoclave aumenta su temperatura, creando el agua líquida que contiene en vapor de agua. El volumen de aire contaminado que se encuentra en el interior del autoclave es sustituido por el vapor se agua creado, y así, se consigue la esterilización. Pero este proceso conlleva un cierto tiempo, aproximadamente unos 20 minutos.

Una vez hecho el medio de cultivo, llega la hora de aislar microorganismos de otro medio de cultivo ya cultivado. Para eso hemos utilizado la técnica de la triple estría.

  • En primer lugar cogemos con el asa de siembra (previamente flameada y esterilizada) una pequeña cantidad del medio de cultivo (donde hay millones de microorganismos) y hacemos la primera estría en un borde.
  • A continuación esterilizamos la asa al rojo vivo y dejamos que se enfríe cerca de la llama.
  • Hacemos la segunda estría utilizando los microorganismos que ya hemos colocado en la primera estría.
  • Volvemos a esterilizar el asa de siembra.
  • Finalmente hacemos la tercera estría, y así, hemos pasado de tener millones de microorganismos a tener células aisladas.

Mediante este proceso hemos aislado tanto levaduras como bacterias lácticas. Hemos metido las levaduras en la estufa a 28ºC y tendremos que esperar entre 24 y 48 para ver los resultados. En el caso de las bacterias, las hemos introducido en la estufa a 37ºC .

Pero antes de meter en la estufa los medios de cultivo, hemos de tener en cuenta que algunos microorganismos, los anaerobios, crecen mejor en ambientes sin oxígeno (anaerobiosis) o con muy poco oxígeno, aproximadamente un 5% (microaerofilias). Éste es el caso de los Lactobacillus, uno de los micoorganismos que hemos cultivado. Para conseguir este ambiente colocamos las placas petri en una jarra en la que también metemos un sobre que llevará a cabo una reacción exotérmica y que se encargará de consumir el oxígeno, disminuyendo su concentración.

Finalmente, cuando el autoclave ha terminado de trabajar los medios de cultivo, hemos comprobado que estos estaban estériles mediante unas cintas de autoclave que habíamos colocado previamente, y en las cuales aparecen unas tiras negras en el caso de que esté esterilizado. Finalmente hemos llenado las placas petri con las disoluciones que habíamos preparado y así hemos conseguido nuestros propios medios de cultivo.

Después de todo esté trabajo,  ha llegado la hora de ir a comer, y allí nos hemos reunido todos juntos, emocionados y contándonos todas las experiencias que habíamos vivido en nuestro primer día aquí. Veremos que nos espera mañana!

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