Praktikum 2011 en la ETS Ing. Agronómica Medio Natural

Proyecto 3.8- Identificación de levaduras aisladas en mosto de uva

DÍA 1

Hoy ha sido nuestro primer día en Praktikum. Por la mañana hemos asistido a una reunión en la que nos han explicado brevemente cuatro de los grados que se pueden hacer en la Universidad Politécnica de Valencia. Éstos son: Grado en Biotecnología, Grado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos, Grado en Ingeniería Agroalimentaria y del Medio Rural y Grado en Ingeniería Forestal y del Medio Natural.

Después de esto, los tutores que nos han asignado, Ana y Jorge, nos han llevado a mi compañera Mar y a mí a conocer el área por donde deberemos movernos en los próximos días. Hemos visto los laboratorios así como algunos despachos y otras zonas del edificio.

Una vez instaladas, hemos dejado nuestras cosas en una taquilla y nos hemos puesto la bata para entrar al laboratorio. Para comenzar, nos han hablado del tema de las levaduras y su papel en la fermentación alcohólica. Nos han comentado que nuestro proyecto trataría sobre el cultivo, la purificación y la identificación de distintos cultivos de levaduras aisladas de mosto de uva, lo que se denomina selección clonal.

Esta selección clonal consiste en obtener levaduras autóctonas con buenas características enológicas, partiendo de una sóla célula para así obtener colonias con el mismo genoma. Para llevarla a cabo, podemos utilizar mosto obtenido a partir de las uvas, una vez maduras, o aislar las levaduras, que se encuentran adheridas a la pruina (capa cerúlea del grano de uva). Cabe resaltar el hecho de que cuanto más madura está la uva, más se adhieren las levaduras.

A continuación nos han dado una hoja de normas de seguridad en el laboratorio de microbiología, las cuales hay que tener muy en cuenta a la hora de manipular cualquier cosa en el laboratorio. La lista de normas incluye datos muy interesantes, como por ejemplo:

• Lavarse las manos antes de entrar en el laboratorio y tras finalizar la sesión de prácticas
• Llevar el pelo recogido
• Evitar los guantes de látex si se trabaja cerca del mechero, ya que las quemaduras son muy peligrosas
• Después de los análisis, los cultivos se retirarán para su destrucción en autoclave

Estas normas aseguran que el trabajo en el laboratorio sea completamente seguro para todos aquellos que las respeten.

Una vez asimilada esta información, hemos entrado en acción con nuestro primer pequeño experimento. Lo hemos llamado «¿Están en mis manos los microorganismos?». El procedimiento ha sido sencillo. En un medio de cultivo general hemos tocado con las manos sin lavar. Lo hemos metido en una estufa a 28ºC y mañana comprobaremos el resultado.

Luego hemos empezado a preparar un medio de cultivo, formado por YPD, y otro igual al que además le hemos añadido cloranfenicol. El segundo se trata de un medio de cultivo selectivo, que inhibe el crecimiento de las bacterias, pero no el de las levaduras. El YPD está compuesto de: extracto de levadura, peptona, glucosa (a lo que se añade agua destilada).

Las cantidades que hemos añadido para preparar 300ml de medio de cultivo han sido:

• 15g de polvo YPD Broth
• 4,5g de agar para conseguir algo de solidez
• 0,15g de cloranfenicol en sólo uno de ellos

Una vez lista la mezcla en el erlenmeyer, la hemos agitado bien, hemos tapado la abertura con un algodón y papel de aluminio por encima para evitar que se contamine una vez sacado del autoclave. Nos han recalcado que el recipiente en el que se hace esto ha de tener una capacidad de al menos el doble del volumen de mezcla que prepararemos, puesto que al hervir podría salirse si fuera demasiado pequeño. Una vez controlado esto, hemos metido las mezclas en el autoclave.

Este aparato es un recipiente metálico de paredes gruesas con cierre hermético que permite trabajar a altas temperaturas y presiones, para realizar una esterilización con vapor de agua. Funciona eliminando por completo el aire contaminado que haya quedado en el interior al cerrarlo, y sustituyéndolo totalmente por vapor de agua. Pasados unos 20 minutos (según el programa que elijas) el interior del autoclave estará estéril.

Para finalizar el día de hoy, hemos aprendido a aislar microorganismos de un medio de cultivo. Para ello, hay que realizar una triple estría. Se utiliza un asa de siembra, un mechero, y una placa petri con medio de cultivo. El procedimiento consiste en esterilizar el asa de siembra (compuesta por una aleación de Níquel y Cromo) calentándola con el mechero hasta que se pone al rojo vivo. Para no quemar los microorganismos, hay que esperar unos segundos con el asa de siembra cerca del mechero, pero no encima, de modo que baja la temperatura. Se coge una muestra del microorganismo y se esparce en el medio de cultivo suavemente, creando la primera estría. Se vuelve a esterilizar el asa de siembra para arrastrar de esa estría una segunda y se repite el proceso para obtener la tercera. El resultado debería ser la obtención de colonias aisladas.

Tras realizar este proceso de aislamiento de microorganismos varias veces, hemos metido las placas petri en las estufas a 28ºC, esperando que entre 24-48 horas tengamos los primeros resultados, ya que estas levaduras se dividen por fisión binaria y su crecimiento es exponencial (2^n), lo que quiere decir que en poco tiempo pueden llegar a formar colonias con grandes cantidades de microorganismos. Una de las levaduras que hemos utilizado se llama Saccharomyces cerevisiae, y ha de incubarse a 28ºC. Contrariamente a ellas, las bacterias Lactobacillus delbruekii bulgaricus han de incubarse a 37ºC.

Por último, hemos visto una jarra de anaerobio, donde hemos metido el cultivo de bacterias antes de llevarlo a la estufa a 37ºC, que encuentran un mejor medio para vivir en zonas poco e incluso nada oxigenadas (microaerofílicos y anaerobios respectivamente). Hemos añadido un sobre dentro de la jarra de anaerobio que reacciona con el oxígeno de su interior dejandolo al 5% de concentración.